細(xì)菌生長(zhǎng)曲線綜述，讓我們先回顧一下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的4個(gè)基本階段:log階段，滯后階段，靜止階段和死亡階段(圖1)。在此期間，細(xì)胞正在適應(yīng)和調(diào)整他們的新環(huán)境。然后，培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在此期間，細(xì)胞迅速分裂，數(shù)量翻倍(大腸桿菌在對(duì)數(shù)期每20分鐘翻一番)。當(dāng)你在液體培養(yǎng)液中達(dá)到最大的細(xì)胞密度時(shí)，細(xì)胞就進(jìn)入了靜止期。在這一階段，細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有整體增加——死亡的細(xì)胞被新分裂的細(xì)胞所取代，但活細(xì)胞的總數(shù)保持不變。如果你在研究孢子形成細(xì)菌，這可能是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞孢子形成的階段，或形成新的孢子。最后，死亡(或下降)階段是由多種因素引起的，包括營(yíng)養(yǎng)或氧氣的缺乏，細(xì)胞代謝引起的介質(zhì)pH值的變化值，或有毒細(xì)胞廢物的積累。細(xì)胞代謝引起的介質(zhì)pH值的變化值，或有毒細(xì)胞廢物的積累。

使用OD600確定您的文化處于什么階段

最簡(jiǎn)單的方法是測(cè)量OD600，或600納米的光密度，來(lái)測(cè)量一個(gè)培養(yǎng)基在其生長(zhǎng)曲線上的距離。這種波長(zhǎng)是專門為細(xì)菌OD測(cè)量而選擇的，因?yàn)榕c紫外線波長(zhǎng)不同，600nm對(duì)培養(yǎng)物無(wú)害。這種波長(zhǎng)通常也不會(huì)被像TSB和LB這樣的黃色介質(zhì)吸收。通過(guò)監(jiān)視OD600的增長(zhǎng)速度，您可以確定培養(yǎng)物的滯后、記錄和固定相。您可以確定培養(yǎng)物的滯后、記錄和固定相。您可以確定培養(yǎng)物的滯后、記錄和固定相。

那么如何測(cè)量呢?對(duì)于一個(gè)簡(jiǎn)單的懸浮在液體中的細(xì)胞，你首先需要零或“空白”的分光光度計(jì)與新鮮的，未接種的媒介減去媒介對(duì)測(cè)量的任何吸收貢獻(xiàn)。然后，取您的文化樣本并測(cè)量OD600。這種測(cè)量方法可以很容易地計(jì)算出培養(yǎng)瓶中每毫升培養(yǎng)細(xì)胞的總數(shù)。還不錯(cuò)吧?盡管如此，還是有一些事情需要注意:

當(dāng)你提取一個(gè)培養(yǎng)基樣本時(shí)，確保你混合的很好，并立即進(jìn)行測(cè)量，因?yàn)榧?xì)胞可以在一分鐘左右的時(shí)間內(nèi)開始沉淀，這將導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

如果細(xì)菌在溶液中形成生物膜或聚集物，這將嚴(yán)重影響測(cè)量的準(zhǔn)確性和精度。在這種情況下，您可能需要對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行聲波降解或進(jìn)一步處理，以分解這些“簇”。查閱有關(guān)您正在使用的菌株的文獻(xiàn)，以避免或消除這個(gè)問(wèn)題。

最重要的是，>1的OD值不準(zhǔn)確!這樣高的OD讀數(shù)超出了大多數(shù)分光光度計(jì)的動(dòng)態(tài)范圍，這意味著這些讀數(shù)不會(huì)隨著細(xì)胞濃度的增加而線性增加。如果你得到的OD值大于1，稀釋你的樣品2倍或更多直到它達(dá)到OD600 < 1。

如果你經(jīng)常用燒瓶培養(yǎng)細(xì)菌，訓(xùn)練自己用眼睛估計(jì)OD值是有幫助的。這樣，當(dāng)燒瓶明顯不在您正在尋找的OD范圍內(nèi)時(shí)，跳過(guò)OD600檢查可以節(jié)省寶貴的時(shí)間。查看本文了解更多信息，并考慮使用微板閱讀器來(lái)提高OD測(cè)量的吞吐量。

其他監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)和代謝的方法

雖然使用一種培養(yǎng)物的OD600來(lái)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)是一種久經(jīng)考驗(yàn)的真實(shí)方法，但是還有其他幾種方法來(lái)評(píng)估細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和代謝。您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其中一些因素對(duì)于您的特定應(yīng)用程序也更相關(guān)或有用！

通過(guò)采集培養(yǎng)物的樣本并在顯微鏡下進(jìn)行檢查，你可以開始對(duì)培養(yǎng)物中活細(xì)胞的近似濃度有一個(gè)了解。額外的好處:你可以比較細(xì)胞的圖片，看看是否有不同的形態(tài)學(xué)批次，或多少營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在一個(gè)孢子形成培養(yǎng)。

溶解氧和二氧化碳?？紤]啤酒(由酵母制成)，康普茶(由酵母和各種細(xì)菌制成)，以及其他由微生物發(fā)酵的飲料。在這些例子中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氧氣(O2)被消耗，二氧化碳(CO2)被形成。同樣的過(guò)程發(fā)生在有氧培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)中!溶解O2和CO2探頭是生物反應(yīng)器中常用的探頭。如果你想要一個(gè)微創(chuàng)的選擇,光學(xué)傳感器(和補(bǔ)丁)存在,使用LED熒光監(jiān)控溶解­2從外面瓶啊!

大多數(shù)細(xì)菌隨著時(shí)間的推移會(huì)降低培養(yǎng)基的pH值，包括大腸桿菌。對(duì)于某些物種來(lái)說(shuō)，酸的產(chǎn)生實(shí)際上會(huì)限制一個(gè)文化的最大生長(zhǎng)和生存能力。與氧傳感器一樣，有方法可以對(duì)燒瓶中的pH值進(jìn)行無(wú)創(chuàng)連續(xù)監(jiān)測(cè)。

糖的分析。有了某些儀器，從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中快速可靠地測(cè)定殘余糖分是可能的。例如，如果你的培養(yǎng)基中主要的碳源是葡萄糖，在細(xì)菌生長(zhǎng)的中途獲取葡萄糖測(cè)量數(shù)據(jù)可以讓你了解培養(yǎng)基在生長(zhǎng)曲線中的位置。

那么你應(yīng)該在什么時(shí)候收獲一種文化呢?

簡(jiǎn)而言之，這完全取決于文化的最終目標(biāo)是什么。例如，我曾經(jīng)大量培育和誘導(dǎo)大腸桿菌過(guò)度表達(dá)非本地蛋白，然后從培養(yǎng)中純化。我經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，我從培養(yǎng)物中獲得的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量取決于我收獲時(shí)的相細(xì)胞。然而，在其他情況下，目標(biāo)只是盡可能多的獲取細(xì)胞。

一旦你知道了需要采集細(xì)胞的特定生長(zhǎng)階段，一定要進(jìn)行一些測(cè)試(包括測(cè)量)，以確保你對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間的評(píng)估是正確的。這將給你一個(gè)強(qiáng)烈的感覺(jué)，你的文化需要多長(zhǎng)時(shí)間準(zhǔn)備收獲，并提供歷史數(shù)據(jù)比較增長(zhǎng)曲線。始終從一個(gè)較小的“種子”文化開始，以獲得可靠的和持續(xù)增長(zhǎng)的燒瓶。最后，如果你不太適應(yīng)減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，可以測(cè)試你的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)幾次。